退火温度计算器旨在计算 PCR 过程中 DNA 引物与其特定靶序列结合的理想温度。该温度对于扩增过程的特异性和效率至关重要，影响分子生物学实验的整体成功。
退火温度计算器公式
退火温度的计算可以通过几种方法进行，包括华莱士规则和考虑引物成分的更细致的公式：
- 使用华莱士规则计算退火温度 (Ta):
- 公式：Ta = 2 * (A 数量 + T 数量) + 4 * (C 数量 + G 数量) – 5
- 地点：
- Ta 是退火温度（摄氏度）
- A 数、T 数、C 数、G 数分别表示引物中腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的数量
- 熔化温度 (Tm) 的精确计算:
- 公式：Tm = 64.9 + 41 * (G 数量 + C 数量 - 16.4) / (A 数量 + T 数量 + G 数量 + C 数量)
- 地点：
- Tm 是熔化温度（摄氏度）
- 退火温度调整:
- 通常，为了实现最佳引物结合，退火温度（Ta）设定为低于熔化温度（Tm）3-5°C。
- 公式：Ta=Tm-5
这些公式使研究人员能够根据他们的引物序列专门定制 PCR 条件，从而优化实验结果。
一般术语表
| 按揭年数 | 定义 |
|---|---|
| 退火温度（Ta） | PCR 过程中引物与目标 DNA 序列结合的温度。 |
| 熔化温度（Tm） | DNA 引物的双链 DNA 解开为单链的温度。 |
| 华莱士规则 | 根据引物的核苷酸组成估算Tm的基本方法。 |
| PCR（聚合酶链反应） | 一种用于制作 DNA 片段多个副本的实验室技术。 |
该表提供了理解和使用退火温度计算器所需的基础知识。
退火温度计算器示例
考虑具有以下核苷酸组成的引物：10 个腺嘌呤、5 个胸腺嘧啶、10 个胞嘧啶和 5 个鸟嘌呤。总 长度 引物的长度为30个碱基：
- 计算熔化温度 (Tm)：Tm = 64.9 + 41 * (15 + 10 – 16.4) / 30 = 69.1°C
- 计算退火温度（Ta）：Ta = 69.1°C – 5 = 64.1°C
这个实际例子演示了如何使用计算器确定典型 PCR 设置的退火温度。
最常见的常见问题解答
哪些因素影响 PCR 中的退火温度？
因素包括引物长度、核苷酸组成和 浓度 反应混合物中的盐和其他成分。
为什么准确的退火温度在 PCR 中很重要？
准确的退火温度确保引物与目标 DNA 特异性结合，最大限度地减少非特异性结合并产生准确的扩增结果。
引物长度如何影响退火温度？
由于较长的 DNA 链之间的氢键增加，较长的引物通常需要更高的退火温度。