Калькулятор температуры отжига предназначен для вычисления идеальной температуры, при которой праймеры ДНК будут связываться со своими определенными целевыми последовательностями во время ПЦР. Эта температура имеет решающее значение для специфичности и затрат процесса амплификации, влияющего на общий успех экспериментов по молекулярной биологии.
Формула расчета температуры отжига
Для расчета температуры отжига можно использовать несколько методов, включая правило Уоллеса и более тонкие формулы, учитывающие состав праймера:
- Температура отжига (Ta) по правилу Уоллеса:
- Формула: Ta = 2 * (число_A + число_T) + 4 * (число_C + число_G) – 5
- Где:
- Ta — температура отжига в градусах Цельсия.
- Number_of_A, Number_of_T, Number_of_C, Number_Of_G обозначают количество оснований аденина, тимина, цитозина и гуанина в праймере.
- Температура плавления (Tm) для точных расчетов:
- Формула: Tm = 64.9 + 41 * (число_G + число_C – 16.4) / (число_A + число_T + число_G + число_C)
- Где:
- Tm – температура плавления в градусах Цельсия.
- Регулировка температуры отжига:
- Обычно температуру отжига (Ta) устанавливают на 3-5°C ниже температуры плавления (Tm) для оптимального связывания праймера.
- Формула: Та = Тм – 5
Эти формулы позволяют исследователям адаптировать условия ПЦР специально к их последовательностям праймеров, тем самым оптимизируя результаты экспериментов.
Таблица общих условий
| Срок | Определение |
|---|---|
| Температура отжига (Ta) | Температура, при которой праймер связывается с целевой последовательностью ДНК во время ПЦР. |
| Температура плавления (Tm) | Температура, при которой двухцепочечная ДНК ДНК-праймера раскручивается на одиночные цепи. |
| Правило Уоллеса | Основной метод оценки Tm на основе нуклеотидного состава праймера. |
| ПЦР (полимеразная цепная реакция) | Лабораторный метод, используемый для создания нескольких копий сегмента ДНК. |
В этой таблице представлены базовые знания, необходимые для понимания и использования калькулятора температуры отжига.
Пример калькулятора температуры отжига
Рассмотрим праймер следующего нуклеотидного состава: 10 аденинов, 5 тиминов, 10 цитозинов и 5 гуанинов. Общая праймера составляет 30 оснований:
- Рассчитаем температуру плавления (Tm): Tm = 64.9 + 41 * (15 + 10 – 16.4) / 30 = 69.1°C.
- Рассчитайте температуру отжига (Ta): Ta = 69.1°C – 5 = 64.1°C.
Этот практический пример демонстрирует, как использовать калькулятор для определения температуры отжига для типичной установки ПЦР.
Наиболее распространенные часто задаваемые вопросы
Факторы включают длину праймера, нуклеотидный состав и концентрации солей и других компонентов в реакционной смеси.
Точная температура отжига гарантирует, что праймер специфически связывается с целевой ДНК, сводя к минимуму неспецифические связывания и обеспечивая точные результаты амплификации.
Более длинные праймеры обычно требуют более высоких температур отжига из-за увеличения водородных связей между более длинными цепями ДНК.